Метод количественной ДНК-диагностики, использующий принципы классической ПЦР, но с возможностью измерения абсолютного и относительного измерения копий ДНК в образце. Количество ДНК измеряется в реальном времени после каждого цикла амплификации. Детекция накопления продуктов реакции (ампликонов) может измеряться двумя способами:
- неспецифически, с помощью интеркалирующих флуоресцентных красителей (напр. SYBRGreen, SYBR Gold)
- с помощью олигонуклеотидов с флуоресцентными метками (повышает специфичность реакции); этот способ используется чаще.
Кривая накопления продуктов реакции отражает 3 стадии: инициации (базовый уровень сигнала), экспоненциальную (накопления продукта) и стадию насыщения, когда график выходит на «плато». Пороговое значение флуоресценции обычно устанавливают выше базового уровня. Номер цикла, при котором флуоресценция превышает фиксированный порог, называют пороговым циклом.
Преимущества ПЦР в реальном времени (по технологии TaqMan):
- Существенное повышение специфичности метода за счет наличия внутреннего зонда;
- Количественное определение в реальном времени
- Снижение риска контаминации (за счет все стадии ПЦР проводятся я в одной пробирке и отсутствие стадии электрофореза)
- Возможность создания мультиплексных систем, позволяющих детектировать несколько генов в одном образце(реакция в одной пробирке)
- Снижение времени проведения реакции
- Повышенная чувствительность и расширенный динамический диапазон (до двукратного изменения начального количества ДНК)
Метод широко используется в научных исследованиях и диагностике (оценка экспрессии генов, генотипирование, мониторинг эффективности терапии, наличие инфекционных агентов и др.)