ПЦР в реальном времени | Генотехнология

ПЦР в реальном времени

Метод количественной ДНК-диагностики,  использующий принципы классической ПЦР, но с возможностью измерения абсолютного и относительного измерения копий ДНК в образце. Количество  ДНК измеряется в реальном времени после каждого цикла амплификации. Детекция накопления продуктов реакции (ампликонов) может измеряться двумя способами:

 

  • неспецифически, с помощью интеркалирующих  флуоресцентных красителей (напр. SYBRGreen, SYBR Gold)
  • с помощью олигонуклеотидов с флуоресцентными метками (повышает специфичность реакции); этот способ используется чаще.

 

Кривая накопления продуктов реакции отражает 3 стадии: инициации (базовый уровень сигнала), экспоненциальную (накопления продукта) и стадию насыщения, когда график выходит на «плато». Пороговое значение флуоресценции обычно устанавливают выше базового уровня. Номер цикла, при котором флуоресценция превышает фиксированный порог, называют пороговым циклом.

 

Преимущества ПЦР в реальном времени (по технологии TaqMan):

 

  • Существенное повышение специфичности метода за счет наличия внутреннего зонда;
  • Количественное определение в реальном времени
  • Снижение риска контаминации (за счет все стадии ПЦР проводятся я в одной пробирке и отсутствие стадии электрофореза)
  • Возможность создания мультиплексных систем, позволяющих детектировать несколько генов в одном образце(реакция в одной пробирке)
  • Снижение времени проведения реакции
  • Повышенная чувствительность и расширенный динамический диапазон (до двукратного изменения начального количества ДНК)

 

Метод широко используется в научных исследованиях  и диагностике (оценка экспрессии генов, генотипирование, мониторинг эффективности терапии, наличие инфекционных агентов и др.)